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      目的基因的名詞解釋_制備方法_制備流程

      時間: 莉莎1157 分享

        目的基因的名詞解釋

        把需要研究的基因稱為目的基因。(一般把需要分析的基因稱靶基因,在基因克隆過程中有時兩者均稱為插入基因,有時三者含義相近。所以有時有些書本上也籠統(tǒng)的稱“用限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因(靶基因)”)。

        目的基因的制備方法

        從細(xì)胞核中直接分離

        簡單的原核生物目的基因可從擬核中直接分離得到,但人類的基因分布在23對染色體上,較難從直接法中得到。

        直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”,又叫“散彈射擊法”。這種方法有如用獵槍發(fā)射的散彈打鳥,無論哪一顆彈粒擊中目標(biāo),都能把鳥打下來。鳥槍法的具體做法是:用限制酶(即限制性內(nèi)切酶)將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段,將這些片段分別載入運(yùn)載體,然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞,讓供體細(xì)胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分別在受體細(xì)胞中大量復(fù)制(在遺傳學(xué)中叫做擴(kuò)增),從中找出含有目的基因的細(xì)胞,再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲,抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。

        用“鳥槍法”獲取目的基因的優(yōu)點是操作簡便,缺點是工作量大,具有一定的盲目性。

        染色體DNA的限制性內(nèi)切酶酶解

        II型限制性內(nèi)切酶可專一性地識別并切割特定的DNA順序,產(chǎn)生不同類型的DNA末端。若載體DNA與插入的DNA片段用同一種內(nèi)切酶消化,或靶DNA與載體DNA末端具有互補(bǔ)的粘性末端,可以直接進(jìn)行連接。

        DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端。當(dāng)限制酶在識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時,產(chǎn)生的是黏性末端,而當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時,產(chǎn)生的則是平末端。

        人工體外合成

        簡短的目的基因可在了解DNA一級結(jié)構(gòu)或多肽鏈一級結(jié)構(gòu)氨基酸編碼的核苷酸序列的基礎(chǔ)上人工合成。

        用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA

        大多數(shù)的目的基因是由mRNA合成cDNA(反轉(zhuǎn)錄DNA)得到。從RNA入手,先從細(xì)胞提取總RNA,然后根據(jù)大多數(shù)真核mRNA含有多聚腺嘌呤(polyadenylic acid ,polyA)尾的特點,用寡聚dT纖維素柱將mRNA分離出,以mRNA為模板,在多聚A尾上結(jié)合12-18個dT的寡聚dT片段,作為合適的起始引物,在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第一條。

        從基因文庫中獲取

        依據(jù):基因的核苷酸序列,功能,在染色體中的位置,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA,翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的性質(zhì)。

        PCR技術(shù)擴(kuò)增

        PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫,由穆里斯等人于1988年發(fā)明的,1993年獲諾貝爾獎。PCR是一種在生物體外迅速擴(kuò)增DNA片斷的技術(shù),它能以極少量的DNA為模板,在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份DNA拷貝。這項技術(shù)解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的問題,被廣泛地應(yīng)用于遺傳疾病的疹斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等方面。PCR的原理是DNA雙鏈復(fù)制的原理,將基因的核苷酸不斷地加以復(fù)制,使其數(shù)量呈指數(shù)增長。利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提,是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成引物(2種)。擴(kuò)增的過程是:目的基因DNA受熱變性后解旋為單鏈,引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合,然后在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸,如此重復(fù)循環(huán)多次。

        目的基因的制備流程

        cDNA鏈,用堿或RNA酶水解除去mRNA,再用DNA聚合酶,最好是Klenow片段合成第二條DNA鏈。雙鏈合成后,用S1核酸酶切去發(fā)夾結(jié)構(gòu),即可獲得雙鏈cDNA。cDNA用于探針制備、序列分析、基因表達(dá)等研究。因此以cDNA為研究材料,反映了mRNA的轉(zhuǎn)錄及對以后翻譯的影響情況,即反映某一基因(DNA)外顯子的情況。

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