免疫學(xué)技術(shù)論文(2)
免疫學(xué)技術(shù)論文
免疫學(xué)技術(shù)論文篇二
EV71免疫學(xué)研究進(jìn)展
【中圖分類號】R19 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1004-7484(2013)04-0081-02
腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬的單正鏈無包膜RNA病毒。1974年Schmidt等人首次從美國加利福尼亞州患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀疾病的嬰兒患者中分離到EV71病毒，隨后世界上許多國家相繼報(bào)道了EV71在不同地區(qū)的流行情況，EV71一共引起了10多次的世界范圍的爆發(fā)和流行，其中又有四次大的流行[2]。我國從2008年阜陽爆發(fā)EV71以來，共報(bào)告手足口病例192344例，發(fā)病率為 37.01/10萬，其中重癥病例2119，死亡病例94，在我國主要流行株已經(jīng)從90年代初的B亞型和C2亞型轉(zhuǎn)變?yōu)镃4亞型。 在丙類傳染病中發(fā)病數(shù)位于第三，而死亡數(shù)為第一位。EV71可經(jīng)消化道、呼吸道傳播，易造成流行。EV7l傳染性強(qiáng)，傳播途徑復(fù)雜，短時間內(nèi)可造成大規(guī)模流行。人對EV71普遍易感，成人多已通過隱性感染獲得免疫力，因此感染后發(fā)病患者主要為學(xué)齡前兒童。EV71感染引起的臨床表現(xiàn)多樣，主要表現(xiàn)為手足口病(hand footmouth disease，HFMD)，部分患兒表現(xiàn)為皰疹性咽峽炎，少部分重癥患者出現(xiàn)腦炎、腦脊髓膜炎、肺水腫、肺出血等。
目前尚無有效疫苗能預(yù)防感染，臨床主要以對癥治療為主，缺乏特異、高效的抗病毒藥物，尤其是EV71感染所致重癥病例病情進(jìn)展快，預(yù)后差，病死率高，對于EV71的基礎(chǔ)研究目前也只停留在比較基礎(chǔ)的水平。研究EV71作為一種病原所引發(fā)的機(jī)體免疫應(yīng)答，對了解病毒的致病機(jī)制、制定預(yù)防診治策略具有重要意義。
一、病毒結(jié)構(gòu)
EV71的病毒顆粒呈二十面體立體對稱近似球形的結(jié)構(gòu)，直徑24～30 nm，無包膜。核衣殼由60個亞單位構(gòu)成，每個亞單位由四種衣殼蛋白(VPl、VP2、VP3、VP4)組成的五聚體構(gòu)成。病毒基因組為7408個核苷酸，僅有一個開放閱讀框(ORF)，編碼含2193個氨基酸的多聚蛋白(Polyrotein)，多聚蛋白進(jìn)一步水解為 VP1，VP2，VP3和VP4，這四個外殼蛋白先形成原聚體，再由5個原聚體結(jié)合形成病毒顆粒。在其兩側(cè)分別為5’～非編碼區(qū)和3’一非編碼區(qū)。3’一非編碼區(qū)的末端含有一個長度可變的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)，而其5’末端共價結(jié)合有一個小分子量的蛋白(VPg)。在這四種結(jié)構(gòu)蛋白中，VP4位于衣殼內(nèi)部，與病毒核心連接，VPl、VP2和VP3均暴露在病毒衣殼表面，帶有抗原表位。VPl還與病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合有關(guān)。
二、病毒受體的研究
腸道病毒在人體內(nèi)具有廣泛的受體，病毒感染人體后可與不同靶組織的受體相結(jié)合，從而出現(xiàn)復(fù)雜的臨床表現(xiàn)。病毒與宿主細(xì)胞受體的特異性結(jié)合決定了病毒感染的組織趨向性，不同種類和型別的腸道病毒，其特異性受體不完全相同。腸道病毒的特異性受體至少包括細(xì)胞間黏附分子 -1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、晚期活化抗原-2(very late activation antigen，VLA-2)、補(bǔ)體衰變加速因子(decay accelerating factor，DAF)等。VP1蛋白在病毒表面形成的峽谷樣結(jié)構(gòu)是受體的結(jié)合位點(diǎn)。感染細(xì)胞時，病毒首先與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，完成吸附過程，然后病毒空間構(gòu)型發(fā)生改變，丟失VP4并最終脫去衣殼，病毒RNA進(jìn)入胞漿。病毒RNA為感染性核酸，進(jìn)入細(xì)胞后可直接起mRNA作用，轉(zhuǎn)譯出多聚蛋白，多聚蛋白經(jīng)酶切后形成病毒結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白。細(xì)胞被感染后約30分鐘，細(xì)胞蛋白合成迅速下降至零，稱為“關(guān)閉”(shut-off)，主要由腸道病毒蛋白酶裂解細(xì)胞真核翻譯起始因子-4G(eukaryote initiation factor 4G，eIF-4G)造成。細(xì)胞蛋白翻譯“關(guān)閉”是腸道病毒細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)的主要機(jī)制。Betsy Yang[7]等在2009年曾報(bào)道在DLD-1人結(jié)腸腺癌細(xì)胞表面的吐液酸化的葡聚糖是EV71病毒的后來，后來日本的兩位科學(xué)家Seiya Yamayoshi和Yorihiro Nishimura等經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)分別證明了清道夫受體B2和P選擇素糖蛋白配體1均是EV71病毒在人細(xì)胞上的受體分子。
三、體液免疫應(yīng)答
特異性體液免疫產(chǎn)生的中和性抗體在病毒感染的預(yù)防以及疾病后期降低病毒載量方面都有很明顯的意義，對EV71引起的體液免疫的研究由來已久，其他體液免疫的研究主要為疾病診斷提供了輔助手段。Foo等在EV71的VPl上發(fā)現(xiàn)一個線性表位SP32，蛋白印記實(shí)驗(yàn)顯示重組表達(dá)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)一SP32融合蛋白能與人EV71 IgG抗體特異性結(jié)合，而與柯薩奇病毒CA9和?？刹《?Echo 6)無反應(yīng)。Wang等[13]設(shè)計(jì)一種檢測抗EV71 IgM的ELISA實(shí)驗(yàn)，用于EV71感染的早期診斷。用該方法檢測236例患者的336份標(biāo)本，以病毒分離和中和實(shí)驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，該ELISA法的敏感性和特異性分別達(dá)到97.7%和93.3%，發(fā)病7 d以內(nèi)IgM即可呈陽性，并可持續(xù)到發(fā)病后94 d。這一方法有望為I臨床早期診斷EV71感染提供輔助手段。Jian-Feng Han等報(bào)道非中和性抗體能在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中可以加重EV71感染后的癥狀，在THP-1細(xì)胞和乳鼠模型中均能增加細(xì)胞的病變和動物的感染癥狀。Shih-Min Wang]等發(fā)現(xiàn)，在針對EV71非中和性抗體存在的條件下，病毒對THP-1細(xì)胞的質(zhì)細(xì)胞病變作用更加強(qiáng)烈。而這一增強(qiáng)作用可以被抗-Fcγ抗體減弱，這個Fcγ主要存在于6-11個月的嬰兒體內(nèi)，這就解釋了為什么嬰幼兒感染感染EV71病毒以后的癥狀要比成人嚴(yán)重。
四、細(xì)胞免疫應(yīng)答
機(jī)體對病毒抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答主要依賴于兩種細(xì)胞，即由主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ限制的CD4+T細(xì)胞和受MHCⅠ分子限制的CD8+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素IL-2、IL-3、IFN-γ和TNF-β等來調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫應(yīng)答，CD4+的Th細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞接觸以輔助CD8+T細(xì)胞分化成CTL細(xì)胞用以特異性殺傷靶細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。既往有對不同腸道病毒結(jié)構(gòu)蛋白保守序列的免疫原性進(jìn)行研究。Cello]等合成15個存在于六種不同腸道病毒結(jié)構(gòu)蛋白上的保守區(qū)域肽段，有9個肽段能刺激健康獻(xiàn)血員的外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，而且其中4個肽段能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖。這一研究表明，在脊髓灰質(zhì)炎病毒1，柯薩奇病毒B3、B5、B6、A9和?？刹《鹃g存在保守的T細(xì)胞表位，這些表位多位于VP2和VP3核殼蛋白上，VP1上較少，而VP4上未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)性的T細(xì)胞表位。提示包括EV71在內(nèi)的腸道病毒結(jié)構(gòu)蛋白保守序列可能存在的表位，值得深入研究。Chang]等對EV71感染后不同疾病轉(zhuǎn)歸患者的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的研究發(fā)現(xiàn)，同時出現(xiàn)腦干腦炎及肺水腫患者的細(xì)胞免疫應(yīng)答顯著低于僅有中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累患者和輕癥患者，具體表現(xiàn)在肺水腫患者的PBMC經(jīng)EV71抗原刺激后，IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-a、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-lα(M1P-lα)等的產(chǎn)生明顯低于其他患者，而不同患者組間中和抗體效價差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測EV71感染后肺水腫的出現(xiàn)可能與特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度較弱有關(guān)。Yang等探討EV71感染后出現(xiàn)腦膜腦炎與未出現(xiàn)腦膜腦炎患兒免疫應(yīng)答的差異，發(fā)現(xiàn)CD4+細(xì)胞表面CD40配體的表達(dá)在腦膜腦炎組顯著下降，檢測該組患兒細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4基因多態(tài)性，顯示其外顯子1的49位上G/G基因型頻率顯著高于無腦膜腦炎組，而中和抗體效價無論在急性期還是康復(fù)期，兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示細(xì)胞免疫的異?？赡芘cEV71感染的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累有關(guān)。 總之，EV71感染后機(jī)體能產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，其中中和抗體在清除病毒、預(yù)防感染中發(fā)揮重要作用，非中和性抗體的存在可以加速疾病的癥狀。而細(xì)胞免疫應(yīng)答可能與感染后病情輕重及不同臨床轉(zhuǎn)歸有 關(guān)。
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