試論大白菜黑斑病室內(nèi)苗期抗性鑒定方法

　　摘要：為了選育大白菜(Brassica campestris L. ssp pekinensis(Lour.) Olsson)抗黑斑病(Alternaria brassicae)新品種和種質(zhì)創(chuàng)新，在室內(nèi)利用6個品種的大白菜研究了接種物濃度、苗齡和溫度對大白菜黑斑病發(fā)病的影響，結(jié)果表明，在(25±1)℃光照培養(yǎng)室內(nèi)，選擇濃度為1.0×104個孢子/mL或1.0×105個孢子/mL的黑斑病病菌孢子懸浮液噴霧接種于苗齡為3～4片真葉的大白菜幼苗，保濕24～48 h，10 d后進(jìn)行病情調(diào)查，可對大白菜種質(zhì)資源抗黑斑病的抗性進(jìn)行正確評價。

　　關(guān)鍵詞：大白菜(Brassica campestris L. ssp pekinensis (Lour.) Olsson);黑斑病(Alternaria brassicae);苗期;抗性鑒定

　　Study on Resistance Identification Method for Black Spot of Chinese Cabbage at Seedling Stage in Laboratory

　　GAN Cai-xia1，ZHU Hua2，CUI Lei1，YUAN Wei-ling1，GAO Xiang1，F(xiàn)U Yi-bin1，MEI Shi-yong1

　　(1. Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China;

　　2. Wuhan Vegetable Technical Service Station， Wuhan 430012，China)

　　Abstract： In order to provide technical support for breeding new varieties and germplasm innovation of Chinese cabbage(Brassica campestris L. ssp pekinensis(Lour.) Olsson) with resistance to black spot(Alternaria brassicae)， the influence of inoculation spore concentration， seedling stage and temperature on black spot occurrence was studied with six varieties. It was showed that by spraying 1.0×104 pfu/mL or 1.0×105 pfu/mL spore suspension on seedling at 3～4 leaf stage and then moisturizing for 24～48 h at (25±1)℃ in door， the resistance of radish varieties on the black spot could be accurately evaluated 10 d after inoculation.

　　Key words： Chinese cabbage(Brassica campestris L. ssp pekinensis(Lour.)Olsson);black spot(Alternaria brassicae);seedling stage; resistance identification

　　大白菜黑斑病是由鏈格孢屬真菌所致的一種常發(fā)性病害，病原菌包括蕓薹鏈格孢(Alternaria brassicae (Berk.) Sacc.)，甘藍(lán)鏈格孢(A. brassicicola)和蘿卜鏈格孢(A. japonica)3個種，其中秋冬白菜黑斑病一般由蕓薹鏈格孢引起，而春夏白菜黑斑病則主要由甘藍(lán)鏈格孢引起，是一種世界性的重要病害，最早于1836年在甘藍(lán)上發(fā)現(xiàn)，1934年開始有為害大白菜的記錄[1]。大白菜黑斑病主要通過種子傳代形成異地擴(kuò)散和蔓延，危害葉片和整株植物，全生育過程發(fā)病，嚴(yán)重影響白菜產(chǎn)量和質(zhì)量，成為大白菜生產(chǎn)的主要病害之一，尤其在美國、芬蘭、加拿大、中國臺灣發(fā)生較重[2，3]。我國最早在1919年于廣東省的甘藍(lán)上發(fā)現(xiàn)，1937年江蘇報道其為害大白菜。20世紀(jì)70年代末，黑斑病在我國大白菜等十字花科蔬菜上逐漸嚴(yán)重起來[4]。

　　大白菜黑斑病主要危害葉片、葉柄及種莢。在真葉上，最初形成圓形退綠斑，病斑擴(kuò)大后轉(zhuǎn)為暗黑色。全株葉片由外向內(nèi)干枯，有明顯較稀的同心輪紋，邊緣有黃色暈環(huán)。潮濕時病斑有一層黑霉。近年來，隨著春大白菜、早秋大白菜的發(fā)展，黑斑病病害問題日益突出，抗病育種是解決大白菜黑斑病經(jīng)濟(jì)而又有效的途徑，而抗性鑒定則是抗病育種的基礎(chǔ)[5]。

　　國內(nèi)外對白菜黑斑病的研究主要集中在黑斑病的發(fā)生和危害、寄主植物的抗性、流行病學(xué)因素、病原物生物學(xué)特性和病原物毒素研究及綜合防治等方面[6]。對于白菜黑斑病，北京市植保所李明遠(yuǎn)[7]進(jìn)行了廣泛深入的研究。1989年樊慕貞等[8]對河北省白菜黑斑病發(fā)生規(guī)律及防治進(jìn)行了研究。而對白菜黑斑病鑒定方法的研究目前還比較少見，急需一種快速、簡便而又精確的抗性鑒定方法，對我國大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，以期建立簡單、快速的品種選育流程。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　供試黑斑病菌種(BHB)采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜科技中心試驗基地。菌種接種前用PDA碳源減半(馬鈴薯200 g，葡萄糖/蔗糖5 g，瓊脂15 g，pH 7.0，去離子水1 000 mL) 固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

　　供試大白菜品種為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜科技中心提供，分別為品種1、品種2、品種3、品種4、品種5、品種6六種類型大白菜品種。

　　將供試的種子播種在裝有滅菌基質(zhì)的花盆(8 cm×8 cm)內(nèi)，出苗后每盆留1～3株。

　　1.2 試驗方法

　　1.2.1 環(huán)境的選擇 在抗病育種過程中，大田期對黑斑病進(jìn)行抗性鑒定往往由于氣候條件不適宜發(fā)病而無法進(jìn)行，而苗期在室內(nèi)進(jìn)行鑒定則溫濕度條件較易控制，鑒定周期短、速度快，能節(jié)省大量人力物力。為此，進(jìn)行了室內(nèi)苗期鑒定蘿卜黑斑病抗性的研究，以找出更適于苗期抗病性鑒定的方法，確定苗期黑斑病適宜的誘導(dǎo)發(fā)病條件，并用篩選出的最適方法對大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行苗期抗病性鑒定和分級，獲得抗黑斑病材料。

　　1.2.2 影響因素的選擇 為選擇一個好的抗性鑒定方法，根據(jù)各國學(xué)者在這方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，即選擇從接種物濃度、苗齡、環(huán)境溫度等各方面探討影響大白菜黑斑病抗性鑒定的因素[9]。

　　1.2.3 接種方法的選擇 接種方法包括拌種法、浸種法、土壤接種法、蘸根接種法、根部切傷接種法、噴霧法和針刺法[10]。在確定以接種物濃度、苗齡和溫度這3個因素為變量的情況下，選擇噴霧法對大白菜苗進(jìn)行接種。

　　1.3 接種

　　將BHB菌株單孢分離同一時期的菌體都配制成孢子濃度為1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106個孢子/mL的懸浮液。

　　當(dāng)大白菜苗長至3～4片真葉期時，將每個品種的1/3再均分成12份，平均分配到(18±1) ℃、(23±1)℃、(28±1)℃ 3個溫度條件下的光照培養(yǎng)室中適應(yīng)2 d，這2 d里，將培養(yǎng)室的溫度每天上調(diào)1 ℃，之后保持不變[11，12]。將等體積的4個不同濃度的菌懸液以噴霧法分別接種于同一品種4份大白菜苗上，蓋上保鮮膜保濕24～48 h后揭掉保鮮膜，誘導(dǎo)發(fā)病，接種后于每天早中晚各澆水1次，于接種后第4、7、10、14和18天進(jìn)行病情調(diào)查[6]。

　　當(dāng)剩余的大白菜苗長至5～6片真葉期時，再將每個品種的1/2搬回培養(yǎng)室進(jìn)行同樣的接種處理。待最后剩余的一批大白菜苗長至7～8片真葉期時，也對其進(jìn)行同樣的接種處理。

　　試驗因素以及水平見表1。表1略

　　1.4 病情指數(shù)分級

　　真葉期接種鑒定調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)[13]：0級，無病;1級，接種葉生褐色小點，無退綠斑;3級，接種葉生直徑3 mm以下的退綠斑，無霉層;5級，接種葉生直徑3 mm以上的退綠斑，有極少霉層，病斑不連成片;7級，接種葉生直徑3 mm以上的退綠斑，有較多的霉層，病斑連成片;9級，接種葉病斑連成片，大面積枯死，霉層明顯。

　　1.5 抗病性劃分

　　病情分級調(diào)查后，計算病情指數(shù)：

　　病情指數(shù)=[Σ(病級數(shù)×該病級發(fā)病株數(shù))/(最高發(fā)病級數(shù)×總調(diào)查株數(shù))]×100[10]。

　　根據(jù)發(fā)病程度進(jìn)行分級[13]。免疫(I)，病情指數(shù)=0;高抗(HR)，病情指數(shù)=0.10～11.11;抗病(R)，病情指數(shù)=11.12～33.33;中抗(MR)，病情指數(shù)=33.34～55.55;感病(S)，病情指數(shù)=55.56～77.77;高感(HS)，病情指數(shù)=77.78～100。

　　1.6 數(shù)據(jù)處理

　　所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5軟件(LSD，P<0.05)處理，采用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行制圖。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 接種天數(shù)對抗性表現(xiàn)的影響

　　由于在接種后第4天和第7天時大白菜苗的感病情況不太明顯，而接種后第14天和第18天，多數(shù)大白菜苗因生理原因?qū)е抡昕菟?，無法判斷其發(fā)病情況，因而在這4個時期進(jìn)行病情調(diào)查時所得到的數(shù)據(jù)有殘缺或不準(zhǔn)確，不能代表各個品種的大白菜苗的感病情況;而在接種后第10天時，這兩方面的問題相對而言比較小，調(diào)查所得的數(shù)據(jù)比較全面，這也與嚴(yán)紅等[14]的研究相符。因此，最終選擇用接種后第10天調(diào)查所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖分析。

　　2.2 接種濃度對抗病性表現(xiàn)的影響

　　從圖1可看出，隨著接種物濃度的增加，其發(fā)病程度也相應(yīng)加強(qiáng)。當(dāng)接種物濃度為1.0×103個孢子/mL時，由于其中某些品種的抗性比較強(qiáng)，發(fā)病程度比較輕，而某些品種的抗性較弱，發(fā)病較重，不能進(jìn)行正確的抗性評價;而當(dāng)接種物濃度為1.0×106個孢子/mL時，6個品種都嚴(yán)重發(fā)病，且基本無差異，也不能進(jìn)行正確的抗性評價;當(dāng)接種物濃度為1.0×104個孢子/mL或1.0×105個孢子/mL時，植株發(fā)病比較重且有差異，參考柯桂蘭等[9]的研究結(jié)果，可作為評價的濃度。

　　2.3 接種苗齡對抗病性表現(xiàn)的影響

　　從圖2可以看出，隨著苗齡的增大，植株發(fā)病程度有所下降，整體的抗病性在增強(qiáng)。當(dāng)苗齡為5～6片真葉或7～8片真葉時，植株發(fā)病程度普遍較低且差異不大，不能進(jìn)行正確的評價;當(dāng)苗齡為3～4片真葉時，抗病性強(qiáng)的品種與抗病性弱的品種間的差異非常明顯，可作為抗病性鑒定評價的苗齡。

　　2.4 接種溫度對抗病性表現(xiàn)的影響

　　由圖3可以看出，溫度與植株發(fā)病程度呈正相關(guān)。當(dāng)環(huán)境溫度為(20±1)℃時，多數(shù)品種的發(fā)病程度都比較低，不能進(jìn)行正確的評價;當(dāng)環(huán)境溫度為(30±1)℃時，6個品種發(fā)病程度都比較嚴(yán)重，且品種間的抗性差異與濃度和苗齡不一致，也不能進(jìn)行正確的抗性評價;當(dāng)環(huán)境溫度為(25±1)℃時，品種間的發(fā)病程度比較明顯且與濃度和苗齡的一致，參考柯桂蘭等[9]的研究結(jié)果，可作為抗性評價的溫度。

　　3 結(jié)論

　　本研究結(jié)果表明，在(25±1) ℃光照培養(yǎng)室內(nèi)，選擇濃度為1.0×104～1.0×105個孢子/mL的黑斑病病菌孢子懸浮液噴霧接種于苗齡為3～4片真葉的大白菜幼苗，保濕24～48 h，10 d后進(jìn)行病情調(diào)查，可對大白菜種質(zhì)資源抗黑斑病的級別進(jìn)行正確評價。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1] 劉紀(jì)書.河北省蔬萊學(xué)會論文集[A].1988.174.

　　[2] 何啟偉，吳春燕，宋廷宇.大白菜良種繁殖技術(shù)[J].長江蔬菜，2007(6)：31-33.

　　[3] 張百俊，張國英，楊東平，等.大白菜主要病害無公害防治技術(shù)[J].長江蔬菜，2009(15)：18-19.

　　[4] 李明遠(yuǎn).十字花科蔬菜黑斑病識別與防治[J].當(dāng)代蔬菜，2004(10)：34-35.

　　[5] 張鳳蘭，徐家炳，嚴(yán) 紅，等.大白菜苗期對黑斑病抗性遺傳規(guī)律的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，1997，12(3)：115-119.

　　[6] 劉 影，馬海霞，楊信東.白菜黑斑病空間分布型研究及殺菌劑篩選[J].北方園藝，2008(10)：171-174.

　　[7] 李明遠(yuǎn).大白菜黑斑病的發(fā)生與防治[J].中國蔬菜，2006(7)：49-50.

　　[8] 樊慕貞，崔麗珍.白菜黑斑病的發(fā)生和化學(xué)防治研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1987，10(1)：53-61.

　　[9] 柯桂蘭，劉煥然，趙稚雅.大白菜黑斑病病原種群組成及人工接種抗性鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，1998(3)：92.

　　[10] 方中達(dá).植病研究方法[M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

　　[11] 楊曉紅，劉天文.大白菜抗軟腐病接種鑒定及抗源篩選研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(5)：67-69.

　　[12] KUNDU S，PATRA M，SAMADDAR K R.Factors affecting growth and sporulation of Alternaria brassicicola[J].Journal of Mycopathological Research，1991，29(1)：17-22.

　　[13] 王鳳敏，張魯剛.春夏大白菜黑斑病病原鑒定和抗性鑒定方法比較[J].植物保護(hù)學(xué)報，2007，12(6)：614-618.

　　[14] 嚴(yán) 紅，李明遠(yuǎn)，柯常取.大白菜苗期接種黑斑病菌保濕時間及調(diào)查期對癥狀表現(xiàn)的影響[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994，12(4)