毛細管電泳及其在種子科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用
毛細管電泳及其在種子科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用
電泳法(CapillaryElectrophoresis，CE)，是2O世紀8O年代問世的一種高效液相分離法，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。目前，它已成為能與20世紀50年代末、6O年代初出現(xiàn)的氣相色譜(GC)以及20世紀70年代初出現(xiàn)的液相色譜(HPLC)相媲美的一種分離技術(shù)，并被認為是當(dāng)代分析科學(xué)最具活力的前沿研究課題。毛細管電泳法因其分離效率高、分析速度快、樣品用量少、抗污染能力強及易自動化等特點而被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、高分子等領(lǐng)域，尤其在生物分析及生命科學(xué)領(lǐng)域中已展示了誘人的應(yīng)用前景口。
1毛細管電泳原理及其特點
毛細管電泳泛指以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)D]。毛細管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)包括一個高壓電源，一根毛細管，一個檢測器及兩個供毛細管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。
毛細管電泳儀的工作原理：毛細管電泳所用的石英毛細管柱，在pHi3情況下，其內(nèi)表面帶負電，和溶液接觸時形成一雙電層。在高電壓作用下，雙電層中的水合陽離子引起流體整體朝負極方向移動的現(xiàn)象叫電滲。粒子在毛細管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和。正離子的運動方向和電滲流一致，故最先流出;中性粒子的電泳速度為“零”，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度;負離子的運動方向與電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實現(xiàn)分離L4]。
與經(jīng)典電泳相比，毛細管電泳法克服了由于焦耳熱引起的譜帶寬，柱效較低的缺點，確保引入高的電場強度，改善分離質(zhì)量Is]，具有分離效率高、速度快和靈敏度高等特點，而且所需樣品少、成本低，更為重要的是，它又是一種自動化的儀器分析方法[a3。毛細管電泳法與高效液相色譜一樣同是液相分離技術(shù)，很大程度上兩者互為補充，但無論從效率、速度、用量和成本來說，毛細管電泳法都顯示了它的優(yōu)勢。如毛細管電泳法成本相對較低，且可通過改變操作模式和緩沖液成分，根據(jù)不同的分子性質(zhì)(如大小、電荷數(shù)、手征性、疏水性等)對極廣泛的物質(zhì)進行有效分離，而高效液相色譜法要用價格昂貴的柱子和溶劑.可見，毛細管電泳法具有儀器簡單、分離模式多樣化、應(yīng)用范圍廣、分析速度快、分離效率高、靈敏度高、分析成本低、環(huán)境污染小等特點。
2.毛細管電泳檢測方法及其影響因素
傳統(tǒng)毛細管電泳檢測方法主要有光學(xué)檢測、電化學(xué)檢測、質(zhì)譜檢測等。光學(xué)檢測又可分為紫外吸收檢測(UVabsorptiondetection)、熱光學(xué)檢測(Thermoop-ticaldetection)、熒光檢測(F1uorescencedetection)、化學(xué)發(fā)光檢測(Chemiluminescencedetection)等;電化學(xué)檢測可分為電位分析檢測(Potentiometricdetection)、電導(dǎo)率檢測(Conductivitydetection)、電勢梯度檢測(Potentialgradientdetection)、安培分析檢測(Amper-ometricdetection)等。隨著毛細管電泳技術(shù)的不斷發(fā)展，逐漸出現(xiàn)了非水毛細管電泳(Nonqueouscapillaryelectrophoresis，NACE)、毛細管陣列電泳(Capillaryarrayelectrophoresis，CAE)，毛細管電泳免疫分析(Capillary electrophoresisbased immunoassay，CE—IA)、毛細管電色譜(Capillaryelectrochromatography，CEC)等分支。非水毛細管電泳法是在以非水為溶劑的緩沖溶液中進行的，主要用于分析不易溶于水而易溶于有機溶劑的物質(zhì)，分離在水溶劑毛細管電泳中淌度十分相似的物質(zhì)。毛細管陣列電泳是在常規(guī)毛細管電泳法原理和技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合微型制造技術(shù)設(shè)計出來的一種檢測技術(shù)，是_種新型的生物芯片。毛細管電泳免疫分析技術(shù)利用抗原抗體復(fù)合物與游離的抗原、抗體在電泳行為上的差異，將毛細管電泳作為分離與檢測手段。毛細管電色譜是一種在毛細管內(nèi)充填、涂布或鍵合色譜固定相，用電滲流作為驅(qū)動力的分離模式嘲。
影響毛細管電泳法分離的因素主要有以下幾個方面：①毛細管。毛細管是關(guān)鍵部件，管徑、管長、不同物質(zhì)的涂層厚度對分辨率均有影響。②電泳緩沖液。電滲分離現(xiàn)象在毛細管電泳中起著非常重要的作用，而緩沖液的pH值及濃度對電滲的影響很大，并對分離度產(chǎn)生效應(yīng)。③電壓。在進行電泳時，進樣電壓和操作電壓對分辨率及操作時間會產(chǎn)生影響。④電泳溫度。
電流通過毛細管會產(chǎn)生熱量，升高溫度，使物理參數(shù)發(fā)生改變，造成樣品遷移時間、峰面積的偏差和分離效率下降。
3.毛細管電泳在種子科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景
3.1在品種鑒定和物種分類上的應(yīng)用
毛細管電泳與傳統(tǒng)的凝膠電泳相比，具有分析速度快，分辨能力高，分析過程全自動化及樣品用量少等優(yōu)點。自1988年發(fā)表第一批關(guān)于毛細管電泳用于DNA分析的文獻后，即引起眾多科學(xué)家的關(guān)注。目前，毛細管電泳已被用于DNA純度檢測，PCR產(chǎn)物分析，DNA序列分析以及酶和多糖蛋白的結(jié)構(gòu)、純度、穩(wěn)定性等方面的研究[7叫。如能將毛細管電泳運用于種子生物技術(shù)領(lǐng)域的研究，對拓寬種子中酶蛋白、特異基因片段的分離手段和加快物種的鑒定分類有重要意義。
3.2在種子離子分析方面的應(yīng)用
毛細管電泳在食品分析中應(yīng)用最廣泛和成熟的領(lǐng)域即毛細管離子電泳(CIE)。目前，毛細管離子電泳已被用來測定多種食品基質(zhì)中的無機離子，如K、Ca抖、Na、NH、SO、F一、Br一等。種子中的離子分析多采用原子吸收光譜法，該儀器不利于普及，應(yīng)用毛細管電泳的獨特優(yōu)勢，將大大簡化已有的檢測方法，使種子微量元素的測定更方便、更經(jīng)濟n。
3.3在種子農(nóng)藥殘留分析方面的應(yīng)用
農(nóng)藥包括殺蟲劑和除草劑兩大類。過去農(nóng)藥殘留量常用高效液相色譜的方法測定，但隨著毛細管電泳的發(fā)展，它越來越多地被用于農(nóng)藥殘留分析。目前毛細管電泳已被用于飲用水、牛奶、啤酒、谷物、馬鈴薯和豬肉等食品中農(nóng)藥殘留的測定。加入WTO后，為了消除貿(mào)易壁壘，我國執(zhí)行了更為嚴格的農(nóng)殘標準，這就要求我們在種子種植、加工等一系列環(huán)節(jié)加強對農(nóng)殘含量的監(jiān)控，在這方面國內(nèi)外已有報道。毛細管電泳因其獨特的優(yōu)勢，將會在種子農(nóng)殘檢驗領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。
3.4在研究種子遺傳分析中的應(yīng)用
毛細管電泳在種子遺傳分析中的應(yīng)用國內(nèi)外已有報道，如Gerber等采用高效毛細管電泳對大豆種子品質(zhì)的遺傳學(xué)進行研究分析引。變異是群體進化的基礎(chǔ)，品種內(nèi)變異的兩個常用度量指標是雜合度和多態(tài)信息含量。由于微衛(wèi)星標記呈共顯性遺傳，基因型直接反映表型，因此，等位基因頻率可通過簡單計算獲得，進而得出雜合度和多態(tài)信息含量。應(yīng)用毛細管電泳快速靈敏地對微衛(wèi)星標記進行檢測分析，將極大地推動這方面的研究，這些成果將為開展品種保存、選育及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)]。
3.5在種子營養(yǎng)成分分析方面的應(yīng)用
對種子蛋白的分離與表征，傳統(tǒng)方法多是采用不同模式的聚丙烯酰胺凝膠電泳和高效液相色譜，這些方法在實際操作中都存在不同程度的局限性，如聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作復(fù)雜，無法進行定量分析，且分辨率不高，還要使用有毒試劑等;高效液相色譜雖然在一定程度上克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳的不足，但其運行成本高，難以在實踐中廣泛應(yīng)用。毛細管電泳是從傳統(tǒng)電泳發(fā)展而來的一種高效、新型的分離分析技術(shù)，在蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等生物分子的分離分析方面顯示出極大的優(yōu)越性。目前這一技術(shù)在作物種子蛋白研究中已取得重要進展，并顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
高效毛細管電泳在煙草糖類化合物分析中的應(yīng)用國內(nèi)外已有報道，如劉少民等采用高效毛細管電泳一安培法分離測定了煙草中4種寡糖。馬強等分離測定了煙草中的5種還原糖(葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和麥芽糖)Ll。毛細管電泳還可用于種子內(nèi)氨基酸、有機酸等組分的測定，這在食品等領(lǐng)域已有較多報道[1，可借鑒到種子分析領(lǐng)域，發(fā)展種子營養(yǎng)成分分析方法。
作為一種高效分離技術(shù)，毛細管電泳在食品、藥物、環(huán)境、生物堿、毒品、天然產(chǎn)物等方面的應(yīng)用已顯示出巨大的潛力。目前，毛細管電泳在種子分析領(lǐng)域的應(yīng)用才剛剛起步，國內(nèi)已有種子部門開展此方面的應(yīng)用研究，隨著毛細管電泳技術(shù)研究的深入、毛細管電泳儀器的普及和種子分析檢驗技術(shù)的發(fā)展。可以預(yù)計，毛細管電泳將在種子領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。